嗜水气单胞菌感染对黄鳝Moronecidin基因表达的影响

2019-07-08 03:30:59 江苏农业科学2019年10期

张钊 涂娇 张小雪

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摘要:为研究嗜水气单胞菌对黄鳝Moronecidin基因表达的影响,用不同浓度嗜水气单胞菌菌液感染健康黄鳝,采用荧光定量PCR方法分别检测染菌黄鳝脾脏、肾脏和肌肉中Moronecidin基因在感染后12、24、48 h的表达量。结果表明,Moronecidin基因在健康黄鳝的上述3种组织器官中都有表达;腹腔注射嗜水气单胞菌后,该基因的表达量明显升高。随着感染时间的延长,3种组织器官中Moronecidin基因的表达量在处理1(菌液浓度为1亿CFU/mL)均呈现逐渐升高的趋势,处理2(菌液浓度为2亿CFU/mL)脾脏中Moronecidin基因的表达量随处理时间延长而逐渐升高,而肾脏和肌肉中的表达量则呈先升高后降低的趋势;处理3(4亿CFU/mL)Moronecidin基因的表达量在3种组织器官中均逐渐降低。

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关键词:黄鳝;嗜水气单胞菌;Moronecidin基因

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中图分类号: S917  文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2019)10-0188-05

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鱼类依赖非特异性免疫系统通过产生各种免疫细胞[1-2]、免疫因子[3-4]等非特异性的识别并作用于病原体,达到清除体内抗原、抵御水生环境中各种病原体入侵的目的。抗菌肽(AMPs)是非特异性免疫系统的重要组成成分,存在于植物、动物以及人类等几乎所有的生命体中,具有抗菌谱广、高效、热稳定性强、不产生耐药性等特点[5-6]。研究发现,抗菌肽除了具有直接抑制细菌、真菌、病毒和原虫的抗菌活性外,还具有增强免疫细胞趋化性[7]、抑制炎症[8-9]和激活免疫细胞[10]等生物学活性。

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Moronecidin抗菌肽属于Piscidin(毒鱼豆素)家族,其家族成员包括dicentracin、epinecidin、myxindin以及胸腺素[11]等。2002年Lauth等从杂交条纹鲈鱼(Hybrid striped)的鳃和皮肤中首次分离获得Moronecidin抗菌肽,并验证了它对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌活性[12];2008年Falco等的研究表明,在感染病原体后,虹鳟各组织器官中Moronecidin抗菌肽的表达量最高[13]。同时,在其他鱼类体内也相继发现了Moronecidin抗菌肽,包括大西洋鳕鱼(Gadus morhua)[14]、真鲷(Chrysophrys major)[15]、欧洲鲈鱼(Dicentrarchus labrax)[16]、石斑鱼(Epinephelus coioides)[17]等。到目前为止,Moronecidin抗菌肽仅被发现存在于鱼类中。有关Moronecidin基因的研究发现,比目鱼完整的Moronecidin基因cDNA序列包含1个信号肽和磷酸腺苷(AMP)12域[18],而条石鲷鱼中Moronecidin基因的编码区含有204bp,共67个氨基酸残基,并预测其三级结构是一种两亲性螺旋结构[19]。前人关于Moronecidin基因的研究主要集中在海洋鱼类,而有关该基因在淡水鱼黄鳝体内表达的情况尚未见报道。

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本研究以黄鳝Moronecidin基因为研究对象,通过荧光定量PCR技术检测该基因在感染嗜水气单胞菌后黄鳝脾脏等3种组织器官中的表达量变化,为进一步探讨黄鳝免疫机制,实现新型药物的开发提供依据。

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1 材料与方法

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1.1 试验动物与菌株

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试验用60尾黄鳝[体质量为(104.5±13.1) g]采集于贵州省贵阳市花溪地区池塘和田间;试验用嗜水气单胞菌菌株(编号:ATCC7966)由贵州大学动物科学学院陈江凤老师馈赠。

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1.2 主要仪器设备和试剂

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1.2.1 主要仪器设备 VD-650超净工作台、101-2型电热鼓风干燥箱、80-1电动离心机、光学显微镜CH20BIMF200、血球计数板、FA1004电子天平、78-1磁力加热搅拌器、HZQ-F160型恒温摇床、高压灭菌锅、80-2112-21型紫外分光光度仪、PTC-1148 PCR扩增仪、DYY-6C型电泳仪、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计、C1000 Touch荧光定量PCR仪、Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统。

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1.2.2 主要试剂与试剂盒 无水乙醇、三氯甲烷、琼脂糖、Gold View染液[生工生物工程(上海)股份有限公司]、loading buffer[生工生物工程(上海)股份有限公司]、DM2000(鼎国生物公司)、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN)、TransStart Tip GreenqPCR SuperMix(TransGen Biotech)、Taq PCR Master Mix(TransGen Biotech)。

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1.3 试验方法

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1.3.1 菌液培養及配制 制备LB固体培养基,取储存的菌株涂抹在培养基上,经复壮后转移到液体培养基中,于28 ℃恒温摇床培养24 h,取少量菌液离心提纯,加入少量无菌生理盐水稀释后用平板活菌计数法测定菌液浓度。稀释菌液浓度至 4亿CFU/mL 备用。

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1.3.2 试验分组感染 清洗养殖所用水箱,以0.7%生理盐水浸泡 1 d。将黄鳝随机分成4组,每组15尾,放入水箱用无氯水暂养2 d。对照组每尾注射0.2 mL生理盐水。其余3组为处理组,按照注射菌液的浓度分为处理1(每尾黄鳝注射02 mL浓度为1亿CFU/mL的嗜水气单胞菌菌液)、处理2(每尾黄鳝注射0.2 mL浓度为2亿CFU/mL的嗜水气单胞菌菌液)、处理3(每尾黄鳝分别注射0.2 mL浓度为 4亿CFU/mL 的嗜水气单胞菌菌液)。注射后用乙醇棉球对注射部位进行消毒,然后放入水箱中,并加盖防逃。

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1.3.3 组织取样 分别在感染嗜水气单胞菌12、24、48 h后进行取材,每个浓度组各时间点分别取5尾黄鳝,解剖并分别取肾脏、脾脏、肌肉等置于无酶冷冻管中,迅速放入液氮冷冻后转入-80 ℃冰箱中保存备用。

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1.3.4 引物的设计与合成 根据转录组测序获得的抗菌肽Moronecidin基因序列,并参考GenBank中该基因序列,使用Primer Premier 5.0进行引物的设计,参照王霞等的研究结果[20],内参基因选择黄鳝的β-actin基因。引物合成由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成,用去离子水溶解后于-20 ℃保存。引物序列信息如表1所示。

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1.3.5 样品总RNA的提取及检测

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1.3.5.1 总RNA的提取 使用天根生化科技(北京)有限公司生产的RNAsimple Total RNA Kit进行总RNA的提取。

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1.3.5.2 总RNA的检测 对RNA样品进行超微量紫外分光光度和凝胶电泳双重检测。凝胶制备和电泳检测:称取琼脂糖0.66 g,装入锥形瓶中,加入70 mL TAE缓冲液,加热煮沸后于室温静置冷却至50 ℃左右,加入核酸染料5 μL,摇匀后迅速倒胶。将提取的总RNA样品置于冰上解凍,取1 μL loading buffer(上样缓冲液)与4 μL RNA样品混合,点样,电泳。

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1.3.6 cDNA第一链的合成 选择质量较高的RNA样品进行cDNA第一链的合成,合成前将样品RNA浓度调成一致,使用天根生化科技(北京)有限公司生产的试剂盒对提取的总RNA进行反转录,按说明书步骤在冰上进行操作(为减少试验误差,保证每个反应管准确加入反应液,进行反应前将各反应液按比例混合配成混合液,再分装到各管),具体如下:

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(1)将RNA样品以及反转录试剂盒内所有试剂解冻后置于冰上,使用前用漩涡振荡器混匀并简短离心。

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(2)去除基因组:配制混合液(2 μL 5×gDNA缓冲液,1 μL 总RNA,用RNase-Free ddH2O补足至10 μL),充分混匀并简短离心,42 ℃条件下孵育3 min后置于冰上。

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(3)配制混合液(2 μL 10×Fast RT Buffer,1 μL RT Enzyme Mix,2 μL FQ-RT Primer Mix,用RNase-Free ddH2O补足至10 μL),混匀,简短离心。

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(4)将反转录反应中的Mix,加到gDNA去除步骤的反应液中,充分混匀,简短离心,42 ℃孵育15 min。

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(5)95 ℃孵育3 min后置于冰上,所得cDNA用β-actin引物进行扩增以检测质量,用于后续试验或低温保存。

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1.3.7 PCR反应体系及程序

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1.3.7.1 PCR反应体系 20 μL PCR反应体系如下:Taq PCR Master Mix 10 μL(1×),模板cDNA 1 μL (0.1~10 ng),Primer F(10 μmol/L) 1 μL(0.5 μmol/L),Primer R(10 μmol/L) 1 μL(0.5 μmol/L),RNase-Free ddH2O 7 μL。

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1.3.7.2 Moronecidin PCR反应程序 反应程序如下:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,51 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,31个循环;72 ℃终延伸10 min。

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1.3.8 琼脂糖凝胶电泳检测目的基因 称取0.66 g琼脂糖倒入锥形瓶中,加入60 mL 1×TAE缓冲液,加热煮沸溶解后,放置于室温下冷却至50~60 ℃(不烫手),加入5 μL Gold View染液,用玻璃棒搅拌均匀,迅速倒入制胶板,插入梳子。冷却凝固后取出梳子,加样,放入电泳槽,100 V电泳20 min左右,凝胶成像。

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1.3.9 Moronecidin基因相对表达量的测定 以反转录所得cDNA作为荧光定量PCR的模板,对Moronecidin基因的相对表达量进行测定,建立标准曲线。反应体系和反应条件如下:

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(1)荧光定量PCR反应体系。20 μL荧光定量PCR反应体系如下:10 μL 2× TransStart Tip Green qPCR SuperMix,0.4 μL(0.2 μmol/L)Primer-F,0.4 μL(0.2 μmol/L) Primer-R,2 μL模板cDNA,7.2 μL RNase-Free ddH2O。

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(2)荧光定量 PCR 反应条件(两步法)。具体步骤如下:94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s,51 ℃ 30 s,39个循环,荧光信号采集;95 ℃ 1 min,51 ℃ 1 min,95 ℃ 5 s,得到溶解曲线。

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1.4 数据统计与分析

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本试验所得实时荧光定量PCR原始数据使用2-ΔΔCT方法进行处理,分析Moronecidin基因在黄鳝肾脏等3种组织器官中的表达量。处理后的数据使用统计软件SPSS 17.0进行单因素统计分析,所得数据均为平均值±标准差,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

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2 结果与分析

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2.1 总RNA提取结果

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试验共提取了108个总RNA样品。紫外分光光度计检测显示,总RNA的浓度在130~800 ng/μL之间,且D260 nm/D280 nm值在1.8~2.0之间,证明总RNA浓度和纯度较高。电泳检测结果显示,28S和18S条带清晰,证明总RNA完整,可用于后续PCR试验。

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2.2 cDNA检测及β-actin cDNA PCR扩增结果

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取1 μL cDNA,超微量紫外分光光度计测定结果显示,cDNA浓度均在1 000 ng/μL以上,且D260 nm/D280 nm值在 1.8~2.0之间,说明cDNA浓度较高且完整,可用于下一步荧光定量PCR试验。由图1可知,以反转录所得cDNA为模板,用β-actin引物进行扩增,并通过凝胶电泳成像进行检测,得到的条带分明,无杂带,每组获得的DNA片段均在 344 bp 左右,说明β-actin基因在黄鳝RNA样品中的表达稳定,可作为内参基因使用。

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2.3 cDNA的PCR扩增

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分别在健康黄鳝3种组织器官样品中挑选4个cDNA样品作为模板,对Moronecidin目的基因进行扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测并成像(图2),所得条带单一明亮,每组均扩增得到约291 bp的DNA片段,说明Moronecidin基因在健康黄鳝中有表达。

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2.4 引物特异性检测

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通过qRT-PCR技术检测分析感染嗜水气单胞菌后黄鳝各时间点脾脏、肾脏、肌肉组织中Moronecidin基因的表达量,得到β-actin基因扩增曲线和溶解曲线(图3)、Moronecidin基因扩增曲线和溶解曲线(图4)。由图3和图4可以看出,2个基因扩增曲线均呈“S”形,且曲线平行性好,2个基因的溶解温度分别为82.5 ℃和86.5 ℃,溶解曲线峰值单一,说明设计的荧光定量引物特异性较好,没有引物二聚体和产生非特异性扩增。

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2.5 Moronecidin基因表达量的变化

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以β-actin为内参作对照,在不同处理浓度和处理时间下,对Moronecidin基因在黄鳝3种组织器官中的相对表达量进行检测,检测结果采用2-ΔΔCT法进行计算,结果以对照组 12 h 的表达量为对照,设置其数值为1。

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2.5.1 脾脏Moronecidin基因的表达 由图5可知,随着试验时间的推移,对照组脾脏Moronecidin基因的表达量有些许升高 但差异不明显。处理1和处理2在感染嗜水气单胞菌后,Moronecidin基因表达量均随着处理时间的延长而增加,且增加显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);处理2在感染24 h和48 h时Moronecidin基因表达量极显著提高(P<0.01);而处理3则随感染时间的延长,Moronecidin基因表达量与对照相比呈先升高后降低的变化趋势,且随着处理时间的延长,表达量下降十分明显。与对照组相比,各处理组Moronecidin基因表达量整体呈上调趋势,处理2在感染48 h时,基因表达量达到最高值。

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2.5.2 肾脏Moronecidin基因的表达 由图6可知,随着試验时间的延长,对照组肾脏Moronecidin基因相对表达量有些许变化,但差异不明显。各处理组在感染初期,肾脏Moronecidin基因表达量均增加,随着处理菌液浓度的升高,Moronecidin基因表达量在12 h内均增加;处理2在24 h达到最高值,而处理3在12 h与对照相比增加极显著;处理2的相对表达量在12~48 h内呈先增加后降低的趋势,处理3则持续降低。

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2.5.3 肌肉Moronecidin基因的表达 由图7可知,对照组肌肉中Moronecidin基因相对表达量变化不明显。与对照组相比,在感染嗜水气单胞菌后,黄鳝肌肉中Moronecidin基因表达量均升高;处理1该基因的表达量随着处理时间的增加而增加,而处理2先增加后降低,在感染24 h时该基因的相对表达量达最高值,差异极显著,但随着处理时间的延长,该基因表达量又明显下降;处理3在感染初期该基因的表达量最高,而后持续下降到对照组水平。

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3 讨论

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3.1 Moronecidin基因在不同鱼类器官中的表达量

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研究表明,Moronecidin基因在多种健康鱼类的各组织器官(如脾脏、肾脏、肝脏、肌肉、心脏、胃等)中均有表达,但表达量的差异并不显著。用细菌或病毒诱导后,Moronecidin基因表达量显著升高,且在不同器官中的表达量变化情况不同:条石鲷(Oplegnathus fasciatus)在感染真鲷虹彩病毒后,Moronecidin基因表达量显著升高,且在脾脏中的表达量最高,在头肾和鳃中次之[19];通过注射杀鲑气单胞菌进行诱导,提高了大西洋鳕鱼(Gadus morhua)脾脏、头肾中Moronecidin基因表达量,且脾脏中24 h时的表达量变化最显著[21]。与前人的研究结果类似,本试验中Moronecidin基因在健康黄鳝的脾脏、肾脏和肌肉中均有表达,且该基因的表达量在感染嗜水气单胞菌初期均明显上调,随注射菌液的浓度升高而发生显著变化。在脾脏中该基因的表达量相比另外2种组织器官高,其次是肾脏,肌肉中的表达量相对较低。试验结果表明,在鱼类受到病菌感染时,Moronecidin基因在免疫系统中的表达量显著增加,说明其编码的抗菌肽参与了抵抗病菌的侵扰。但对于不同的鱼和感染不同的菌时,其表达量升高的时间和升高的量却有所不同。

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3.2 Moronecidin基因的表达量与黄鳝脏器功能的相关性

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在感染嗜水气单胞菌48 h后,处理2和处理3的3种组织器官中Moronecidin基因表达量均有下降趋势,推测原因可能是感染初期,黄鳝机体的免疫应答功能正常,Moronecidin基因表达量随着感染时间和感染菌浓度的增加逐渐增加;但在感染后期,黄鳝身体的免疫功能不敌病菌的攻击,黄鳝脏器免疫应答能力下降,导致黄鳝抗菌肽合成能力降低。这是影响Moronecidin基因后期表达量的可能原因之一。

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3.3 嗜水气单胞菌感染和取材时间的确定

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研究表明,黄鳝在感染嗜水气单胞菌12 h后就开始表现出出血病的症状[22],其脏器功能受到严重损伤,72 h后全部死亡[23]。本试验根据前人的研究以及预试验的情况,选择在48 h内取材,以避开染菌黄鳝全部死亡而无材料可取的问题。

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参考文献:

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